TØ 17 – Lipider og cellemembraner

1 Opgave 1. Membransammensætning

1.1 Sammenlign membransmeltetemperaturer

For to membransystemer, hvor den ene er sammensat af phospholipider med mættede acylkæder på 20 kulstofatomer og den anden af kæder af samme længde men med cis-dobbeltbindinger på både C-5, C-8, C-11 og C-14, hvilke forskelle i smeltetemperatur vil du så forvente?

Bakterier med visse mutationer er ikke i stand til at syntetisere fedtsyrer og inkorporerer derfor fedtsyrer fra mediet i deres membraner.

1.2 Forudsig fedtsyresammensætning ved temperatur

Antag at du har to kulturer, der hver indeholder en blanding af forskellige typer lige-kædede fedtsyrer, nogle mættede og andre umættede og med varierende kædelængde fra 10-20 kulstofatomer. Hvis den ene kultur fastholdes ved 18°C og den anden ved 40°C over flere generationer, hvilke forskelle vil du så forvente at opleve i sammensætningen af de to kulturers cellemembraner?

1.3 Sammenlign hopanoider og kolesterol

Hopanoider er pentacykliske molekyler, der findes i bakterier og visse planter. En typisk hopanoidstruktur er vist nedenfor. Sammenlign strukturen med kolesterol.

bacteriohopanetetrol

1.4 Forudsig hopanoidernes membraneffekt

Hvilken effekt vil du forvente at hopanoid har på den bakterielle cellemembran?

2 Opgave 2. Helical wheel

Membranspændende helicer består typisk af 18 to 20 aminosyrer.

2.1 Beregn hydrofob membranbredde

Beregn bredden af den hydrofobe del af cellemembranen baseret på dette.

Sekvensen af sådan en helix kan plottes i et såkaldt helical wheel, der viser positionen af hver aminosyrerest rundt om helicens akse.

2.2 Fortolk helical wheel-plot

Forklar hvilke egenskaber ved transmembrane helicer, der kan forudsiges på baggrund af et helical wheel-plot.

2.3 Analysér amfipatisk helix

I eksemplet nedenfor, analysér positionen af de hydrofobe og hydrofile aminosyrerester. Hvordan stabiliseres de hydrofile sidekæder inde i membranen?

Ser-Val-Tyr-Asp-Ile-Leu-Glu-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Met-Asn-His-Ala-Val-Ser-Gly

1

2.4 Vis prostaglandins ligander i PyMOL

Lav en scene, kaldet F1, der viser prostaglandin (PDB-ID: 1PTH). Hvilke ligander er bundet? Hvilke tror I findes i den native struktur og hvilke er produkt af krystalliseringsmetoden?

2.5 Analysér elektrostatisk membranlokalisering

Analyser den elektrostatiske overflade af prostaglandin. Lav en scene, kaldet F2, der viser dette. Hvordan er prostaglandin lokaliseret til membranen - forklar ud fra det beregnede elektrostatiske potentiale?

2.6 Analysér TM-helicernes elektrostatik

Kig nærmere på alphahelicerne mellem rest 74 og 124 og undersøg deres elektrostatiske overflade. Hint: Lav alphahelicerne et objekt. Analyser de enkelte helicers ligesom I gjorde med helix-wheel plottet. Stemmer det overens med det forventede?

3 Opgave 3. Hydropatiplot

3.1 Identificér transmembrane segmenter

Analysér nedenstående hydropatiplot for tilstedeværelse af transmembrane segmenter:

hydropatiplot1
hydropatiplot2
hydropatiplot3

3.2 Vurdér analysens usikkerheder

Hvilke usikkerheder ligger der i analysen?

4 Opgave 4. Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)

Kvinder med brystkræft udvikler af og til resistens mod et bredt spektrum af cytotoxiske medikamenter brugt i kemoterapien. Baggrunden for dette synes at ligge i en opregulering af ekspression af en række multidrug-resistance proteiner tilhørende gruppen af membranassocierede ABC-transportere. BCRP er en sådan transporter, hvis aminosyresekvens udledt fra cDNA er vist nedenfor.

1 20 40 60

MSSSNVEVFI PVSQGNTNGF PATASNDLKA FTEGAVLSFH NICYRVKLKS GFLPCRKPVE

80 100 120

KEILSNINGI MKPGLNAILG PTGGGKSSLL DVLAARKDPS GLSGDVLING APRPANFKCN

140 160 180

SGYVVQDDVV MGTLTVRENL QFSAALRLAT TMTNHEKNER INRVIQELGL DKVADSKVGT

200 220 240

QFIRGVSGGE RKRTSIGMEL ITDPSILFLD EPTTGLDSST ANAVLLLLKR MSKQGRTIIF

260 280 300

SIHQPRYSIF KLFDSLTLLA SGRLMFHGPA QEALGYFESA GYHCEAYNNP ADFFLDIING

320 340 360

DSTAVALNRE EDFKATEIIE PSKQDKPLIE KLAEIYVNAS FYKETKAELH QLSGGEKKKK

380 400 420

ITVFKEISYT TSFCHQLRWV SKRSFKNLLG NPQASIAQII VTVVLGLVIG AIYFGLKNDS

440 460 480

TGIQNRAGVL FFLTTNQCFS VVSAVELFVV EKKLFIHEYI SGYYRVSSYF LGKLLSDLLP

500 520 540

MRMLPSIIFT CIVYFMLGLK PKADAFFVMM FTLMMVAYSA SSMALAIAAG QSVVSVATLL

560 580 600

MTICFVFMMI FSGLLVNLTT IASWLSWLQY FSIPRYGFTA LQHNEFLGQN FCPGLNATGN

620 640

NPCNYATCTG EEYLVKQGID LSPWGLWKNH VALACMIVIF LTIAYLKLLF LKKYS

Hydrofobicitetsanalyse af BCRP giver desuden følgende resultat:

2.1

4.1 Identificér TM-helicer i BCRP-hydropatiplot

Hvilke egenskaber af hydropatiplottet understøtter idéen om at BCRP indeholder transmembrane helicer? 

4.2 Anslå antal og placering af TM-helicer

Anslå antallet og den omtrentlige placering af de transmembrane helicer i BCRP.

ABC-transportere indeholder en såkaldt ATP-bindende kassette og benytter energien fra ATP til selve eksportprocessen.

4.3 Find ATP-bindende kassette i sekvens

Foreslå hvilken del af sekvensen ovenfor, der indeholder den ATP-bindende kassette.

For at forstå foldningen af membranproteinet indsatte man et peptid med sekvensen YPYDVPDYA på 12 forskellige positioner i BCRP-sekvensen. De resulterende konstrukter (samt vildtype BCRP og en negativ kontrol) blev herefter transfekteret i epithelceller og analyseret for evnen til at binde et radioaktivt mærket antistof rejst mod YPYDVPDYA-sekvensen. Resultatet af analysen er vist i tabellen nedenfor.

Konstrukt

Substitution

(position fra-til)

 Radioaktiv mærkning
vildtype -
negativ kontrol -
N-term 2 - 10 -
1 405 - 413 -
2 416 - 424 ++
3 450 - 458 -
4 455 - 463 -
5 475 - 483 -
6 485 - 493 -
7 498 - 506 +
8 540 - 548 -
9 570 - 578 ++
10 635 - 643 -
C-term 655 - 663 -

Topologisk analyse af BCRP. ++ stærk, + medium og – ingen mærkning.    

4.4 Tegn BCRP-topologi i membran

Lav en skitse af BCRP som det er indlejret i cellemembranen. Er N- og C-terminalerne placeret på samme eller modsatte side af membranen?

4.5 Angiv mulige N-glykosyleringssites

Angiv mulige N-glykosyleringssites i sekvensen for BCRP.

For at undersøge om BCRP er glykosyleret, muterede man desuden specifikke asparaginrester. Proteinekstrakter fra celler transfekteret med mutant BCRP blev derefter analyseret ved SDS-PAGE før og efter behandling med PNGase F. Resultatet af analysen vises nedenfor.

2.2

4.6 Fortolk glykosyleringsanalysen

Hvad fortæller analysen om glycosyleringerne i BCRP? Begrund dit svar.

5 Opgave 5. 5’-Nucleotidase

Enzymet 5’-nucleotidase (5’-ribonucleotide phosphohydrolase) er et glycoprotein, der findes associeret med plasmamembranen i mange celler. Enzymet kan forholdsvis let isoleres fra placenta ved brug af detergenter og har en masse på 71 kDa som bedømt med SDS-PAGE.

5.1 Beskriv 5’-nucleotidasens reaktion

Hvilken type reaktion antyder navnet at 5’-nucleotidase udfører?

Ved gelfiltrering af det ekstraherede enzym på Sephacryl S-300-søjle under tilstedeværelse af 0.1% Triton X-100 (en detergent), eluerer enzymet svarende til et 150 kDa protein. Uden detergent eluerer enzymet i void-volumen som vist nedenfor.

3.1

Gelfiltrering af 5’-nucleotidase med (fyldte cirkler) eller uden (hule cirkler) Triton X-100 til stede. Pilene angiver positionen af (a) thyroglobulin (670 KDa), (b) ferritin (440 KDa), (c) immunoglobulin G (160 KDa) og (d) serum albumin (68 KDa).  Vo er søjlens void-volumen.

5.2 Forklar detergentens rolle i oprensning

Beskriv den rolle, detergenten spiller i oprensningen.

5.3 Bestem kvarternær struktur

Hvad er den mest sandsynlige kvarternære struktur af enzymet, når det er bundet til cellemembranen?

Aminosyresekvensen af human placental 5’-nukleotidase afledt fra cDNA er vist nedenfor. Enzymet syntetiseres med et signalpeptid på 26 rester samt et stærkt hydrofobt område umiddelbart før stopkodon.

1 30 60

MCPRAARAPA TLLLALGAVL WPAAGAWELT ILHTNDVHSR LEQTSEDSSK CVNASRCMGG

90 120

VARLFTKVQQ IRRAEPNVLL LDAGDQYQGT IWFTVYKGAE VAHFMNALRY DAMALGNHEF

150 180

DNGVEGLIEP LLKEAKFPIL SANIKAKGPL ASQISGLYLP YKVLPVGDEV VGIVGYTSKE

210 240

TPFLSNPGTN LVFEDEITAL QPEVDKLKTL NVNKIIALGH SGFEMDKLIA QKVRGVDVVV

270 300

GGHSNTFLYT GNPPSKEVPA GKYPFIVTSD DGRKVPVVQA YAFGKYLGYL KIEFDERGNV

330 360

ISSHGNPILL NSSIPEDPSI KADINKWRIK LDNYSTQELG KTIVYLDGSS QSCRFRECNM

390 420

GNLICDAMIN NNLRHTDEMF WNHVSMCILN GGGIRSPIDE RNNGTITWEN LAAVLPFGGT

450 480

FDLVQLKGST LKKAFEHSVH RYGQSTGEFL QVGGIHVVYD LSRKPGDRVV KLDVLCTKCR

510 540

VPSYDPLKMD EVYKVILPNF LANGGDGFQM IKDELLRHDS GDQDINVVST YISKMKVIYP

570

AVEGRIKFST GSHCHGSFSL IFLSLWAVIF VLYQ

For at forstå enzymets associering med membranen blev det oprensede protein opløst i 45% myresyre og nedbrudt med CNBr i 20 timer, hvorefter reaktionsblandingen blev udrystet med hexan. Efter centrifugering observerede man tre lag, øverst et lag bestående af hexan, i bunden et lag af vandig myresyre og i interfasen mellem disse, et tyndt ugennemsigtigt lag. Dette tynde lag viste sig at indeholde et 3 kDa fragment, der efterfølgende blev behandlet med en endopeptidase specifik for lysinrester. Efter endnu en hexanekstraktion kunne man isolere et dipeptid fra interfasen.

5.4 Forklar interfaselokalisering

Hvorfor findes 3 kDa-fragmentet og dipeptidet i interfasen mellem hexanfasen og den vandige fase?

![](media/image88.png){width="5.617646544181977in" height="4.956792432195975in"}

Aminosyresekvensen af CNBr-fragmentet og dipeptidet kan ses i Tabel 1 nedenfor mens sammensætningen af fragmenterne er vist i Tabel 2. Begge fragmenter indeholder et komplekst glykolipid og udover komponenterne listet i tabellerne indeholder fragmenterne også glycerol og phosphat. Glykosamine var desuden på formen N-acetyl glukosamine.

5.5 Lokalisér fragmenter i sekvensen

Lokalisér 3 kDa-fragmentet og dipeptidet i aminosyresekvensen. Hvilken rest udgør C-terminalen i det modne enzym?
 

5.6 Find glykolipid-bindingsrest

Hvilken aminosyrerest er kovalent bundet til glykolipidet?
 

5.7 Identificér GPI-membrananker

Enzymet kan frigøres fra membranen ved behandling med en inositolspecifik phospholipase C. Hvordan kunne man forestille sig at det er forankret til membranen?
 

5.8 Beskriv GPI-ankermodifikation

Foreslå hvordan det hydrofobe område nær C-terminalen kan være involveret modifikation af enzymet. Hvor i cellen finder denne modifikation sted?
 

5.9 Bestem enzymets membranlokalisering

På hvilken side af plasmamembranen er 5’-nucleotidase lokaliseret? Diskutér mulige, biologiske roller for enzymet.